منحنی‌های کالیبراسیون برای درک پاسخ ابزاری به یک آنالیت و پیش‌بینی غلظت در یک نمونه ناشناخته استفاده می‌شوند. به طور کلی، مجموعه‌ای از نمونه‌های استاندارد با غلظت‌های مختلف ساخته می‌شوند که محدوده‌ای شامل نمونه ناشناخته مورد نظر را در بر می‌گیرند و پاسخ ابزاری در هر غلظت ثبت می‌شود. برای دقت بیشتر و درک خطا، پاسخ در هر غلظت می‌تواند تکرار شود تا یک میله خطا به دست آید. سپس داده‌ها با یک تابع متناسب می‌شوند تا بتوان غلظت‌های ناشناخته را پیش‌بینی کرد. به طور معمول، پاسخ خطی است، اما می‌توان منحنی را با سایر توابع نیز ساخت، مشروط بر اینکه تابع شناخته شده باشد. منحنی کالیبراسیون می‌تواند برای محاسبه حد تشخیص و حد کمی‌سازی استفاده شود.

 

هنگام تهیه محلول‌ها برای منحنی کالیبراسیون، هر محلول می‌تواند به صورت جداگانه تهیه شود. با این حال، این روش می‌تواند مقدار زیادی مواد اولیه نیاز داشته باشد و زمان‌بر باشد. روش دیگر برای تهیه غلظت‌های مختلف یک محلول استفاده از رقیق‌سازی‌های سریالی است. در رقیق‌سازی‌های سریالی، یک نمونه غلیظ به صورت مرحله‌ای رقیق می‌شود تا غلظت‌های پایین‌تر به دست آید. نمونه بعدی از رقیق‌سازی قبلی ساخته می‌شود و معمولاً ضریب رقیق‌سازی ثابت نگه داشته می‌شود. مزیت این روش این است که فقط یک محلول اولیه مورد نیاز است. عیب آن این است که هر گونه خطا در تهیه محلول‌ها – پیپت‌کردن، وزن‌کردن و غیره – با ساخت محلول‌های بیشتر منتشر می‌شود. بنابراین، باید در تهیه محلول اولیه دقت کرد.

همجنین بخوانید: الزامات مهم آزمایشگاه کالیبراسیون

چرا نمودار کالیبراسیون مهم است؟

 یک منحنی کالیبراسیون، که به آن منحنی استاندارد نیز گفته می‌شود، روشی برای شناسایی غلظت یک ماده ناشناخته است. این منحنی‌ها از نقاط داده مواد شناخته‌شده در غلظت‌های مختلف استفاده می‌کنند و پژوهشگران یا توسعه‌دهندگان می‌توانند از این منحنی‌ها برای تعیین محل یک ماده ناشناخته بر روی نمودار استفاده کنند.

 

اصطلاحات و تعاریف در رسم منحنی کالیبراسیون

1-نمودار کالیبراسیون (Calibration Diagram)

این نمودار به صورت گرافیکی رابطه بین نشاندهی و نتیجه اندازه‌گیری متناظر را نمایش می‌دهد. نمودار کالیبراسیون به صورت نواری بر روی یک صفحه تعریف می‌شود که توسط محورهای نشاندهی و نتیجه اندازه‌گیری مشخص می‌شود. این نمودار بیانگر رابطه‌ای بین نشاندهی و مقادیر کمیت اندازه‌گیری شده است. این رابطه یک به چند بوده و عرض نوار مربوط به نشاندهی نشان‌دهنده عدم‌قطعیت اندازه‌گیری دستگاهی است. سایر تعابیر برای این رابطه شامل منحنی کالیبراسیون و عدم‌قطعیت اندازه‌گیری آن، جدول کالیبراسیون یا مجموعه‌ای از توابع است. این مفهوم زمانی به کالیبراسیون مرتبط می‌شود که عدم‌قطعیت اندازه‌گیری دستگاهی در مقایسه با عدم‌قطعیت‌های مربوط به مقادیر کمیت استانداردهای اندازه‌گیری بزرگ‌تر باشد.

2- منحنی کالیبراسیون (Calibration Curve)

این منحنی بیانگر رابطه بین نشاندهی و مقدار کمیت اندازه‌گیری شده متناظر است. منحنی کالیبراسیون یک رابطه یک به یک است که نتیجه اندازه‌گیری هیچ اطلاعاتی درباره عدم‌قطعیت اندازه‌گیری ندارد.

3- خطی‌بودن (Linearity)

توانایی روش در به دست آوردن سیگنال‌هایی که به طور مستقیم با مقدار اندازه‌گیری شده در نمونه متناسب هستند.

4- محدوده خطی‌بودن (Linearity Range)

این محدوده از گستره اندازه‌گیری است که در آن سیگنال به طور مستقیم با مقدار اندازه‌گیری شده در نمونه متناسب است.

5- حساسیت (Sensitivity)

حساسیت نشان‌دهنده میزان تغییرات در پاسخ اندازه‌گیری شده نسبت به تغییرات ایجاد شده در مقدار اندازه‌گیری شده است. حساسیت به عنوان شیب منحنی کالیبراسیون تعریف می‌شود. اگر محورهای X و Y هم واحد باشند، روشی که حساسیت آن به یک نزدیک‌تر است، مطلوب‌تر است. در صورتی که محورهای X و Y هم واحد نباشند، روشی که دارای شیب بزرگی باشد، توانایی بهتری برای تفکیک تفاوت‌های کوچک در مقادیر اندازه‌گیری شده دارد. هرچه شیب منحنی کالیبراسیون بزرگ‌تر باشد، توانایی روش در تشخیص تغییرات کوچک در مقدار اندازه‌گیری شده بیشتر است.

6- ماده مرجع (Reference Material)

ماده‌ای که دارای خصوصیات مشخصی است که به اندازه کافی همگن و پایدار بوده و برای استفاده در اندازه‌گیری یا آزمایش خصوصیات نامی مشخص شده، مناسب است.

چگونه نمودار کالیبراسیون رسم کنیم؟

برای رسم یک نمودار کالیبراسیون، بدون توجه به روش یا دستگاه مورد استفاده، باید یک روند مشخص را دنبال کنید. در ادامه، مراحل را به ترتیب شرح می‌دهیم تا بتوانید یک نمودار کالیبراسیون دقیق ایجاد کنید:

مرحله 1 : تهیه محلول استوک غلیظ

یک محلول استوک غلیظ از استاندارد را با توزین محلول و انتقال آن به یک فلاسک حجمی با حلال تهیه کنید. این راهنمای گام به گام برای تهیه محلول‌های آبی را مشاهده کنید.

مرحله ۲: تهیه استانداردهای منحنی کالیبراسیون

انجام رقیق‌سازی سریالی

یک سری فلاسک‌های حجمی یا میکروتیوب‌ها را برچسب‌گذاری کنید. برای داشتن یک منحنی کالیبراسیون خوب، حداقل پنج استاندارد توصیه می‌شود.

حجم مورد نیاز از استاندارد را با پیپت به اولین فلاسک یا میکروتیوب منتقل کنید. نوک پیپت را تغییر دهید، حجم مورد نیاز از حلال را به همان فلاسک یا میکروتیوب اضافه کرده و مخلوط کنید.

این فرآیند را با پیپت‌کردن از محلول قبلی به فلاسک یا میکروتیوب جدید و افزودن حلال تکرار کنید.

آماده‌سازی نمونه‌ها و ناشناخته‌ها

استانداردها را به کووت‌ها منتقل کنید.

نمونه‌های ناشناخته را به کووت‌ها منتقل کنید. نمونه‌های ناشناخته باید بافر و pH مشابه استانداردها داشته باشند.

مرحله ۳: اندازه‌گیری استانداردها و نمونه‌ها با اسپکتروفوتومتر

هر استاندارد را در اسپکتروفوتومتر UV-Vis قرار دهید و یک خوانش بگیرید. بین سه تا پنج خوانش برای هر استاندارد بگیرید و داده‌ها را در یک صفحه‌گسترده ثبت کنید.

این فرآیند را برای نمونه‌های ناشناخته تکرار کنید.

مرحله ۴: رسم داده‌ها

داده‌ها را با قرار دادن جذب در محور y و غلظت در محور x رسم کنید.

اگر نمونه‌ها سه‌بار اندازه‌گیری شدند، از این داده‌ها برای تعیین انحراف استاندارد استفاده کرده و میله‌های خطا را اضافه کنید.

مرحله ۵: بررسی منحنی کالیبراسیون

منحنی را بررسی کنید. منحنی کالیبراسیون باید خطی باشد و یک بخش غیرخطی داشته باشد—این بخش نشان‌دهنده حد خطی بودن (LOL) است، که نشان می‌دهد آشکارسازی ابزاری به نزدیکی اشباع رسیده است.

برازش داده‌ها با رگرسیون خطی

از نرم‌افزار آماری برای برازش داده‌ها به رگرسیون خطی استفاده کنید.

خروجی معادله زیر است:

y=mx+by = mx + by=mx+b

که در آن m شیب (واحدها جذب/µm) و b عرض از مبدا (واحدها جذب) است.

به دست آوردن ضریب تعیین (R²)

ضریب تعیین (R²) میزان برازش را کمی می‌کند—مربع ضریب همبستگی بین مقادیر واقعی و پیش‌بینی‌شده Y. R² به طور معمول کسری بین 0.0 و 1.0 است، که 1.0 نشان‌دهنده برازش کامل است.

 

روش‌های جایگزین

• روش تک نقطه‌ای: در این روش از یک نمونه مرجع با غلظت شناخته شده برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده می‌شود. این روش ساده‌تر است، اما دقت کمتری نسبت به روش پایه‌ دارد.
• روش براکتینگ: در این روش، نمونه مجهول بین دو نمونه مرجع با غلظت‌های شناخته شده قرار داده می‌شود و مقدار آن از طریق اندازه‌گیری و مقایسه با نمونه‌های مرجع تعیین می‌شود. این روش دقیق‌تر است، اما پیچیده‌تر و زمان‌برتر نیز می‌باشد.

کنترل پایداری

فرض اساسی در روش‌ های انواع کالیبراسیون، پایداری فرآیند اندازه‌گیری در طول دوره اعتبار کالیبراسیون است. به منظور حصول اطمینان از این موضوع، باید از روش‌های کنترلی مناسب استفاده کرد. روش‌های کنترلی همچنین ابزاری برای تخمین دقت مقادیر اندازه‌گیری شده و تعیین زمان نیاز به کالیبراسیون مجدد ارائه می‌دهند.

 

رسم نمودار اسپکتروفتومتری به صورت گام به گام

نمودار اسپکتروفتومتری، که به آن منحنی کالیبراسیون یا منحنی استاندارد نیز گفته می‌شود، ابزاری ضروری برای آنالیز کمی در طیف‌سنجی است. این نمودار رابطه بین غلظت یک ماده و جذب نور آن در طول موج خاص را نشان می‌دهد. با استفاده از نمودار اسپکتروفتومتری، می‌توان غلظت آلاینده‌ها را در نمونه‌های ناشناخته تعیین کرد.

در این مقاله، به طور گام به گام نحوه رسم نمودار اسپکتروفتومتری را شرح می‌دهیم.

مراحل رسم نمودار اسپکتروفتومتری:

1. آماده سازی محلول‌های استاندارد:

   • محلول استوک با غلظت بالا از ماده مورد نظر تهیه کنید.
   • با رقت دادن محلول استوک، چندین محلول استاندارد با غلظت‌های مختلف تهیه کنید.
   • غلظت دقیق هر محلول استاندارد را یادداشت کنید.

2. اندازه‌گیری جذب:

   • از یک اسپکتروفتومتر کالیبره شده استفاده کنید.
   • کویوت خالی را با حلال شستشو دهید و خشک کنید.
   • هر محلول استاندارد را به طور جداگانه در کویوت بریزید و جذب نور را در طول موج مورد نظر اندازه‌گیری کنید.
   • نتایج را به صورت جدول غلظت در مقابل جذب ثبت کنید.

3. رسم نمودار:

   • محور X را به غلظت (مثلاً میلی‌گرم در لیتر) و محور Y را به جذب (مثلاً واحد جذب یا AU) اختصاص دهید.
   • برای هر محلول استاندارد، یک نقطه با مختصات مربوط به غلظت و جذب آن روی نمودار رسم کنید.
   • نقاط را با یک خط صاف یا منحنی به هم وصل کنید.

4. تعیین غلظت نمونه ناشناخته:

   • جذب نمونه ناشناخته را در همان طول موج اندازه‌گیری کنید.
   • نقطه مربوط به جذب نمونه ناشناخته را روی نمودار پیدا کنید.
   • از روی خط یا منحنی، غلظت مربوط به نقطه را به عنوان غلظت نمونه ناشناخته بخوانید.

نکات مهم:

• از حلال و مواد شیمیایی با کیفیت بالا استفاده کنید.
• از کویوت‌های تمیز و عاری از خط و خش استفاده کنید.
• قبل از هر اندازه‌گیری، اسپکتروفتومتر را کالیبره کنید.
• هر اندازه‌گیری را حداقل سه بار تکرار کنید و میانگین را به عنوان نتیجه نهایی در نظر بگیرید.
• در صورت مشاهده انحراف قابل توجه از خط یا منحنی، ممکن است خطایی در اندازه‌گیری‌ها رخ داده باشد.

کاربردهای نمودار اسپکتروفتومتری:

• تعیین غلظت آلاینده‌ها در آب، خاک و هوا
• آنالیز مواد غذایی و دارویی
• مطالعه ساختار مولکول‌ها
• بررسی واکنش‌های شیمیایی

رسم نمودار اسپکتروفتومتری یک روش ساده و کاربردی برای آنالیز کمی در طیف‌سنجی است. با استفاده از این روش می‌توان غلظت مواد مختلف را با دقت بالا تعیین کرد.

چگونه در اکسل منحنی کالیبراسیون ایجاد کنیم؟

ایجاد منحنی کالیبراسیون در اکسل یک فرایند ساده است. برای اطمینان از داشتن یک منحنی کالیبراسیون مناسب، باید چند مرحله را دنبال کنید.

مراحل ایجاد منحنی کالیبراسیون:

برای نمایش نحوه ایجاد منحنی کالیبراسیون در مایکروسافت اکسل، ۱۰ جفت داده نمونه ایجاد می‌کنیم. این جفت داده‌ها شامل مقادیر x و y هستند.

در مثال ما، مقادیر x نشان دهنده استانداردها و مقادیر y معرف پاسخ‌های ما خواهند بود.

پس از بدست آوردن منحنی کالیبراسیون، از توابع شیب (SLOPE) و عرض از مبدا (INTERCEPT) برای محاسبه فرمول منحنی کالیبراسیون استفاده خواهیم کرد.

مرحله ۱: باز کردن منبع داده

در اولین گام، باید پوشه کاری اکسل حاوی مقادیر شناخته شده را که می‌خواهید روی منحنی کالیبراسیون رسم کنید، باز کنید. داده‌های خود را به صورت جفتی مرتب کنید و هر جفت را در یک ردیف با مقادیر در ستون‌های مجاور وارد کنید.

داشتن عنوان‌های مناسب برای ستون‌های داده بهتر است. اگر داده‌ها به ترتیب خاصی نیاز دارند، باید بر اساس یکی از ستون‌ها مرتب‌سازی کنید. شما می‌توانید داده‌های خود را در ستون‌های مقدار x و مقدار y مرتب کنید.

مرحله ۲: ایجاد منحنی کالیبراسیون

گام بعدی شامل ایجاد منحنی کالیبراسیون است. برای ایجاد منحنی، ابتدا باید تمام داده‌هایی را که می‌خواهید استفاده کنید، برجسته کنید.

ابتدا سلول‌های ستون مربوط به مقدار x را انتخاب کنید. می‌توانید روی عنوان ستون سمت راست داده‌های برچسب‌گذاری شده به عنوان x کلیک کنید. با کلیک چپ نگه داشتن ماوس و کشیدن نشانگر ماوس به پایین تا آخرین سلول ستون، آن را انتخاب کنید.

سپس، کلید Ctrl را فشار دهید و سلول‌های ستون حاوی مقدار y را انتخاب کنید. نشانگر ماوس را به پایین تا آخرین سلول ستون بکشید.

بعد، به تب “Insert” در صفحه مایکروسافت اکسل بروید. هنگامی که گزینه باز شد، به منوی “Charts” بروید و سپس به بخش “Scatter” بروید. با کلیک بر روی نماد پراکندگی، گزینه‌های مختلفی از نمودار پراکنده نمایش داده می‌شود. برای بدست آوردن یک نمودار پراکنده با یک نشانگر برای هر جفت داده، به گزینه “Markers Only” بروید.

مرحله ۳: افزودن خط روند

هنگامی که گزینه پراکندگی را باز می‌کنید، یک نمودار با نقاط داده از ستون‌های x و y دریافت خواهید کرد.

برای انتخاب سری داده‌ها، روی یکی از نقاط آبی کلیک کنید. هنگامی که سری انتخاب شد، مایکروسافت اکسل نقاط را مشخص می‌کند.

روی یکی از نقاط مشخص شده کلیک راست کرده و سپس “Add Trendline” را از منوی کشویی انتخاب کنید.

یک خط مستقیم روی نمودار ظاهر می‌شود.

سپس، منوی “Format Trendline” در سمت راست صفحه ظاهر می‌شود. در این منو، کادرهای “Display R-squared value on chart” و “Display Equation on chart” را علامت بزنید.

R-squared یک مقدار عددی است که به شما می‌گوید خط روند چقدر با داده‌ها مطابقت دارد. بهترین مقدار R-squared، ۱.۰۰۰ است، به این معنی که همه نقاط داده خط را لمس می‌کنند. با افزایش اختلاف بین نقاط داده و خط، مقدار R-squared کاهش می‌یابد. کمترین مقدار R-squared می‌تواند ۰.۰۰۰ باشد.

معادله خط روند و مقدار R-squared روی نمودار شما ظاهر می‌شود.

یک مثال از معادله خط روند Y=Mx + B است که در آن M نشان دهنده شیب (SLOPE) و B مخفف عرض از مبدا (y-axis intercept) خط مستقیم است.

پس از اتمام کار با کالیبراسیون، می‌توانید به سراغ سفارشی کردن نمودار بروید. می‌توانید عناوین محورها را اضافه کنید و همچنین عنوان را ویرایش کنید.

برای تغییر عنوان نمودار، روی “Chart Title” کلیک کنید تا متن انتخاب شود. سپس، عنوان جدیدی را تایپ کنید که به بهترین شکل نمودار را توصیف کند، برای مثال “منحنی کالیبراسیون”.

اضافه کردن عنوان به محورها

برای اضافه کردن عنوان به محورهای x و y، ابتدا باید به ابزارهای نمودار (Chart Tools) بروید و سپس به بخش “Design” مراجعه کنید. بعد از آن، روی منوی کشویی “Add a Chart Element” کلیک کنید.

، به “Axis Titles” بروید و سپس گزینه “Primary Horizontal” را انتخاب کنید.

با انتخاب این گزینه، عنوان محور x ظاهر می‌شود. اگر می‌خواهید نام عنوان محور را تغییر دهید، ابتدا متن را انتخاب کرده و سپس نام جدید خود را تایپ کنید.

سپس، دوباره به گزینه “Axis Titles” برگردید و این بار “Primary Vertical” را انتخاب کنید.

با باز کردن این گزینه، عنوان محور y نمایش داده می‌شود. اگر می‌خواهید عنوان را تغییر دهید، ابتدا متن را انتخاب کرده و سپس عنوان جدید خود را تایپ کنید.

با انجام این مراحل، نمودار شما به همراه معادله و تنظیمات دلخواهتان کامل خواهد شد.

نکات:

• می‌توانید از زبانه “Design” برای قالب‌بندی بیشتر نمودار خود، مانند تغییر رنگ خطوط، اضافه کردن نشانگرها و تنظیم مقیاس محورها استفاده کنید.
• برای ذخیره نمودار خود به عنوان یک تصویر، روی آن کلیک راست کرده و “Save as Image” را انتخاب کنید.
• می‌توانید از منحنی کالیبراسیون برای تعیین غلظت نمونه‌های ناشناخته با استفاده از معادله خط روند استفاده کنید.

نتیجه‌گیری

رسم منحنی کالیبراسیون در آزمایشگاه کالیبراسیون نقشی اساسی در تضمین صحت و دقت اندازه‌گیری‌ها دارد. در این مقاله، به اصول کلی این فرآیند، الزامات اعتبار منحنی کالیبراسیون و روش‌های جایگزین در صورت عدم خطی بودن پرداخته شد.